木耳天然黑色素对酒精性肝损伤的体外和体内治疗作用
栏目:重点新闻 发布时间:2021-08-10

以下文章来源于食品科学与人类健康 ,作者FSHW

Introduction

木耳有数千年作为一种传统的可食用真菌的历史。木耳因其较高的营养价值和独特的口味而被世界各地的人食用,特别是在东亚国家,如中国、日本和韩国。现代药理学研究表明,木耳显示出各种生物活性,如降血糖、抗肿瘤、抗氧化和免疫调节活性。黑色素是木耳的主要成分之一,在其生物活性中发挥着重要作用。然而,关于木耳黑色素(AAM)的体外和体内活性的系统研究很少。


黑色素是一种带负电的棕色或黑色生物大分子。作为自然界中一种常见的高分子色素,黑色素存在于植物、动物和微生物中。研究证实,天然黑色素因其良好的抗辐射、吸附重金属、抗氧化和抗菌活性而在物理学、化学和生物学领域具有巨大潜力。
酒精饮料已经成为全世界人们生活的一部分。然而,大量或长期饮酒将导致一系列的疾病,如酒精性肝病(ALD)。近年来,ALD的发病率逐年上升,已成为继病毒性肝炎之后的第二大肝损伤原因。酒精主要由肝脏中的细胞醇脱氢酶(ADH)和过氧化氢酶(CAT)进行代谢。细胞色素P450 2E1(CYP2E1)是微粒体乙醇氧化系统(MEOS)的一种酶,在酒精浓度过高时也参与酒精代谢。在CYP2E1的作用下,会产生大量的活性氧(ROS)。ROS可导致蛋白质变性、酶失活、RNA和DNA损伤,进而导致肝细胞损伤和肝功能异常。核因子E2相关因子2(Nrf2)是一个重要的转录因子,它可以通过增强细胞的抗氧化能力来保护细胞免受氧化应激。Nrf2与细胞质中的Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)结合,在正常情况下Nrf2的表达维持在较低水平。在氧化应激下,Nrf2与Keap1解离,继而进入细胞核并与抗氧化反应元件(ARE)结合,从而诱导II期解毒酶和抗氧化酶的表达,减少酒精对肝脏的危害。然而,过量摄入酒精会产生大量有害的自由基,而内源性氧化剂不足以清除这些自由基,导致氧化应激和肝脏损伤。
在这项研究中,福建农林大学的Ruolin Hou、Xin Liu、Junsheng Fu等探讨了AAM在体外和体内对急性酒精性肝损伤的治疗效果。研究结果丰富了AAM的生物活性,并为开发黑色素相关的健康食品提供了一些思路。


Results

AAM对酒精诱导的L02细胞损伤的影响


AAM对细胞活力的影响是通过MTT实验检测的。如图1A所示,L02细胞的存活率随着酒精浓度的增加而逐渐下降。当酒精浓度为200 μmol/L时,细胞存活率为52.72%。因此,在随后的实验中使用200 μmol/L的酒精进行建模。如图1B所示,与对照组(CON,不含酒精和黑色素)相比,即使在1.6 mg/mL的浓度下,单独的AAM处理对细胞活力没有显著差异,这表明AAM对正常细胞没有毒性。与只用酒精培养24 h的模型组(MOD,仅含酒精醇)相比,AAM处理可剂量依赖地抑制酒精引起的细胞活力下降。当AAM浓度为1.2 mg/mL时,细胞活力达到96.77%,表明AAM显著改善了酒精引起的肝损伤。
AAM对细胞形态的影响通过形态学观察来研究。如图1C所示,在CON和AAM CON(仅1.2 mg/mL AAM)组中,细胞通过静态黏附生长,呈纺锤形或多边形。在MOD中,细胞逐渐收缩为球形,与周围的细胞分离,并且黏附的细胞数量随着时间的推移逐渐减少。与MOD相比,AAM显著改善了酒精引起的细胞形态学变化。


木耳天然黑色素对酒精性肝损伤的体外和体内治疗作用(图1)

图1  AAM 减轻酒精诱导的L02细胞损伤

AAML02细胞中酒精诱导的氧化应激的影响


AAM对酒精诱导的肝细胞氧化应激的影响是通过测量细胞内ROS和谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)的比率来确定的。如图2A所示,与CON相比,用AAM处理的L02细胞和没有酒精刺激的L02细胞的ROS没有增加,说明AAM没有对L02细胞造成氧化应激。而酒精组细胞的ROS水平显著增加,说明酒精引起了细胞的氧化应激。而AAM处理剂量依赖性地抑制了酒精引起的ROS的增加,表明AAM减轻了酒精引起的氧化应激。GSH/GSSG比率如图2B所示,酒精组的GSH/GSSG比率显著低于CON和AAM CON(P<0.01)。这表明,大量的酒精处理削弱了肝细胞的抗氧化能力。与酒精组相比,AAM显著抑制了酒精引起的GSH/GSSG比率下降(P<0.01)。结果表明,AAM通过提高细胞的抗氧化能力来抵御酒精引起的氧化应激。


木耳天然黑色素对酒精性肝损伤的体外和体内治疗作用(图2)

图2  AAM对L02细胞的ROS产生及GSH/GSSG的影响

AAM对小鼠肝脏指数和血清生化指数的影响


肝脏指数可以部分反映肝脏损伤的程度。如图3A所示,与CON组(4.48±0.07)相比,MOD组的小鼠肝脏指数显著升高(5.07±0.07,P<0.01)。与MOD组相比,AAM组和联苯双酯活性对照组(AC)显著抑制了急性肝损伤小鼠肝脏指数的升高(P<0.01)。早期急性肝损伤的标志是甘油三酯(TG)、活性丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)等血清活性的升高。如图3B所示,与CON组((0.82±0.07)mmol/L)相比,MOD组((1.55±0.14)mmol/L)的TG水平增加了89.02%。这表明,大量饮用酒精会导致TG的积累。与MOD组相比,不同浓度的AAM显著降低了血清TG水平(分别为(1.36±0.17)、(1.22±0.18)和(1.22±0.19)mmol/L,P<0.01),AC组也有类似结果。结果表明,AAM减少了由酒精引起的TG的积累。如图3C和3D所示,与CON组(ALT为(19.20±4.52)U/L,AST为(83.07±2.09)U/L)相比,MOD组的ALT和AST水平(ALT为(31.05±3.89)U/L,AST为(94.77±6.33)U/L)分别增加了61.72%和14.08%。这表明,大量的酒精摄入造成了小鼠的肝脏损伤。与MOD组相比,不同浓度的AAM能显著降低急性酒精性肝损伤小鼠的ALT(分别为(23.36±4.08)、(20.11±7.53)和(19.82±3.07)U/L,P<0.05或P<0.01)和AST水平(分别为(87.76±4.41)、(86.53±2.77)和(85.51±2.23)U/L,P<0.01),AC组的结果也类似。结果表明,AAM可以改善酒精引起的肝损伤。


木耳天然黑色素对酒精性肝损伤的体外和体内治疗作用(图3)

图3  AAM对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指数和血清生化指标的影响

AAM对小鼠肝脏中酒精代谢酶和抗氧化酶的影响


ADH是参与酒精代谢的一个关键酶。如图4A所示,与CON组((5.42±0.74)U/mg蛋白)相比,MOD组((6.93±0.86)U/mg蛋白)的ADH活性提高了27.86%,说明人体可以通过提高ADH的水平来提高酒精代谢能力。与MOD相比,不同浓度的AAM处理可提高酒精性肝损伤小鼠的ADH水平(分别为(7.21±0.24)、(8.11±1.18)和(7.95±0.70)U/mg蛋白,P<0.05),AC组也有类似结果。这表明,AAM通过增加ADH水平促进了酒精在肝脏中的代谢。 
肝脏抗氧化酶(CAT、SOD)活性及其脂质产物(MDA)通常被用作早期肝损伤的生化标记。如图4B~4D所示,与CON组(SOD为(120.19±5.30)U/mg蛋白,CAT为(46.52±5.30)U/mg蛋白,MDA为(0.71±0.04)nmol/mg蛋白)相比,MOD组的SOD水平下降23.50%((91.94±2.88)U/mg蛋白,P<0.01),CAT水平下降26.63%((34.13±2.70)U/mg蛋白,P<0.01),MDA水平上升35.21%((0.96±0.13)nmol/mg蛋白,P<0.01)。这些结果表明,大量饮酒破坏了小鼠的抗氧化系统。与MOD组相比,不同浓度的AAM处理能显著提高SOD((100.16±3.32)、(113.38±6.33)和(115.82±3.54)U/mg蛋白,P<0.05或P<0.01)和CAT水平((34.61±1.74)、(41.31±2 48)和(41.93±2.23)U/mg蛋白,M-AAM和H-AAM组的P<0.01),并降低了急性酒精引起的肝损伤小鼠的MDA水平((0.85±0.11),(0.80±0.10),和(0.80±0.07)nmol/mg蛋白,P<0.05或P<0.01)。结果表明,AAM通过提高机体的抗氧化能力改善了酒精诱导的小鼠氧化应激损伤。


木耳天然黑色素对酒精性肝损伤的体外和体内治疗作用(图4)

图4  AAM对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏代谢酶和抗氧化酶的影响

AAM对肝损伤小鼠CYP2E1Nrf2相关基因表达的影响


采用qRT-PCR方法验证AAM对酒精引起的小鼠肝损伤的治疗效果是否与抑制CYP2E1的表达,以及激活Nrf2及其下游抗氧化酶有关。如图5A所示,与CON组相比,MOD组CYP2E1的mRNA表达显著增加(P<0.01),而不同浓度的AAM显著降低CYP2E1的mRNA表达(P<0.01)。如图5B所示,与CON组相比,MOD组Nrf2的mRNA表达显著下降(P<0.05),而M-AAM和H-AAM组Nrf2的mRNA表达显著上升(P<0.05)。此外,AAM提高了Nrf2下游的II期抗氧化酶的表达。如图5C~5F所示,中、高浓度的AAM显著提高了酒精性肝损伤小鼠GclcGclmCATCu-Zn SOD的mRNA表达(P<0.05或P<0.01)。结果表明,AAM对急性酒精性肝损伤小鼠的治疗作用可能与抑制CYP2E1的表达、激活Nrf2及其相关抗氧化酶有关。


木耳天然黑色素对酒精性肝损伤的体外和体内治疗作用(图5)

图5  AAM对急性酒精性肝损伤小鼠CYP2E1Nrf2相关抗氧化酶mRNA表达的影响


Conclusion

      综上所述,木耳的天然色素—黑色素在体外和体内对酒精引起的肝损伤有明显的治疗作用。上述结果为AAM在治疗ALD方面的应用提供了理论依据。

Therapeutic effect of natural melanin from edible fungus Auricularia auricula on alcohol-induced liver damage in vitro and in vivo

Ruolin Houa,b, Xin Liua,b,*, Xiaoping Wuc, Mingfeng Zhengb, Junsheng Fud,*

a The Third People's Hospital Health Care Group of Cixi, Ningbo 315000, China

b College of Food Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

c Mycological Research Center, College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

d College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

*Corresponding authors.

E-mail address: 617956224@qq.com

fujunsheng81@163.com

Abstract

This study explored the therapeutic effects of Auricularia auricula melanin (AAM) on alcoholic liver damage in vitro and in vivo. Human normal liver L02 cells were pre-treated with ethanol and then treated with AAM to explore the therapeutic effect of AAM on ethanol-induced hepatocyte injury. The results show that AAM significantly elevated the cell viability, ameliorated the cell morphology, reduced the ROS and increased the GSH/GSSG of ethanol-pretreated L02 cells. Then, mice were administered with ethanol to induce acute alcoholic liver damage, and administered with AAM to further study the therapeutic effect of AAM on alcoholic liver damage in mice. As a result, AAM reduced the levels of ALT, AST, TG, and MDA, increased the levels of ADH, SOD, and CAT in liver damage mice. The therapeutic effect of AAM may be related to inhibition of CYP2E1 expression and activation of Nrf2 and its downstream antioxidase. The research enriched the bioactivity of AAM and provided some ideas for the development of melanin-related health foods. 


Reference:

HOU R L, LIU X, WU X P, et al. Therapeutic effect of natural melanin from edible fungus Auricularia auricula on alcohol-induced liver damage in vitro and in vivo[J]. Food Science and Human Wellness, 2021, 10(4): 514-522. DOI:10.1016/j.fshw.2021.04.014.


来源:中国食用菌协会